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疏水作用層析法(蛋白質(zhì)純化實驗)原理及步驟

 發(fā)布時間:2023/7/10 點擊量:1646

原理

在疏水層析的主要支持介質(zhì)上含有大小不等的疏水側(cè)鏈,烷基或芳香基,可是絕大多數(shù)情況起作用的是苯基或辛基。當(dāng)碳?xì)?/span>鏈長度增加,即變得更疏水時,疏水強(qiáng)的少量蛋白質(zhì)被吸附。這時疏水相互作用太強(qiáng),需用特殊方法洗脫,可能會導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性。苯基瓊脂糖比辛基瓊脂糖疏水性低,是疏水純化中效果不錯的常用介質(zhì),尤其是試用于純化開始時。

疏水相互作用介質(zhì)

苯基瓊脂糖-O-CH2-CHOH-CH2-O-C6H5

辛基瓊脂糖-O-CH2-CHOH-CH2-O-(CH27-CH3

溶液鹽濃度增加時疏水作用變得更強(qiáng)。因此,大多數(shù)疏水層析程序都是高鹽時上樣,降低鹽濃度時洗脫。所以在硫酸銨沉淀或離子交換層析后可以方便地直接進(jìn)行疏水層析純化。溫和的洗脫條件及高蛋白質(zhì)結(jié)合容置(10~100 mg/ml)使疏水層析在蛋白質(zhì)純化中成為很有價值的方法,也是更換緩沖液的方法之一。

材料與儀器

蛋白質(zhì)樣品液
苯基瓊脂糖 CL-4B NaCl 硫酸銨 磷酸鈉鹽
層析柱

步驟

下述方案設(shè)定樣品是在 75% 硫酸銨沉淀后溶在 50% 硫酸銨溶液的情況。

1. 裝填 5 ml 苯基瓊脂糖 CL-4B 進(jìn)入柱內(nèi);

2. 10 倍柱床體積層析緩沖液(20 mmol/L,pH 7.0 磷酸鈉鹽,50% 硫酸銨)洗柱;

3. 調(diào)整樣品液符合要求,即在 pH 7.0 磷酸鈉緩沖液中含 50% 硫酸銨。上樣總蛋白量 200~500 mg;

4. 3 倍柱床體積層析緩沖液洗柱或洗至 A280 值回到基線;

5. 用分步梯度法洗脫。每步依次分別采用兩倍體積各含 40%、30%、20%、10% 或 0% 硫酸銨的 pH 7.0 磷酸鈉緩沖液洗脫;

6. 再依次用 5 倍體積水、5 倍體積 1 mol/L NaCl 和 5 倍體積水洗柱,使其獲得再生。

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