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離子交換層析實驗(IEC)原理、實驗步驟及注意事項

 發(fā)布時間:2023/7/7 點擊量:1593

原理

離子交換層析(IEC)用于蛋白質(zhì)分離的原理的是基于帶相反電荷分子間的相互吸引力,其中蛋白質(zhì)表面所帶的電荷取決于蛋白質(zhì) pI 和環(huán)境 pH。蛋白質(zhì)的保留時間和鹽濃度決定了其與基質(zhì)表面相互作用的結(jié)合位點數(shù)量。一般在低鹽濃度時使蛋白質(zhì)結(jié)合,而在高鹽濃度時洗脫蛋白質(zhì)。等度洗脫的洗脫窗口很低,因此通常以線性鹽濃度梯度洗脫蛋白質(zhì)。

用途

根據(jù)蛋白質(zhì)表面電荷的不同,分離純化目的蛋白。

材料與儀器

試劑:氯化鈉溶液、平衡緩沖液(20mMTrispH8.0)、洗脫緩沖液(20mMTris+1MNaCLpH8.0)、SDS-PAGE

材料:層析柱、色譜填料

儀器:pH 計、勻質(zhì)機、離心機、蛋白純化儀

步驟

一、IEX 分離

IEX 介質(zhì)填充到柱中以形成填充床,然后用填充基質(zhì)孔隙和顆粒之間空間的緩沖液平衡床。

二、平衡

1、將固定相平衡到所需的起始條件:當達到平衡時,所有固定相帶電基團都與可交換的反離子(例如Na+ Cl-)結(jié)合。

2、選擇起始緩沖液的 pH 值和離子強度,以確保在上樣時,介質(zhì)與目標蛋白質(zhì)結(jié)合,盡量避免與雜質(zhì)結(jié)合。

三、上樣和清洗

1、結(jié)合目標分子:樣品緩沖液應具有與起始緩沖液相同的 pH 值和離子強度,以結(jié)合所有帶電靶蛋白。帶相反電荷的蛋白質(zhì)與 IEX 介質(zhì)的離子基團結(jié)合,集中在色譜柱上。

2、洗掉所有未結(jié)合的材料:不帶電荷的蛋白質(zhì)或與離子基團具有相同電荷的蛋白質(zhì)以與緩沖液流速相同的速度通過色譜柱,在上樣期間或之后洗脫,具體取決于上樣的總體積。

四、洗脫

當所有樣品都已上樣并用起始緩沖液清洗柱子以使所有未結(jié)合的蛋白質(zhì)都通過柱子時,改變條件以洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)。最常見的是,通過增加緩沖液的離子強度(鹽濃度)或偶爾通過改變 pH 值來洗脫蛋白質(zhì)。

注意事項

1、蛋白質(zhì)在低鹽濃度下可能發(fā)生沉淀,所以,在選擇鹽溶液之前,應先評估蛋白質(zhì)復合物在給定鹽溶液中的溶解性。

2、離子交換劑的選擇

必須根據(jù)各類離子交換劑的性質(zhì)以及待分離物質(zhì)的理化性質(zhì),選擇一種較為理想的離子交換劑進行層析分離。選擇離子交換劑的一般原則如下:

選擇陰離子或陽離子交換劑,決定于被分離物質(zhì)所帶的電荷性質(zhì)。如果被分離物質(zhì)帶正電荷,應選擇陽離子交換劑;如帶負電荷,應選擇陰離子交換劑;如被分離物為兩性離子,則一般應根據(jù)其在穩(wěn)定性質(zhì)來選擇交換劑的種類。

蛋白質(zhì)屬于兩性電解質(zhì),所帶電荷取決于所處緩沖液的 pH 大小。當?shù)鞍踪|(zhì)等電點大于其所在緩沖液 pH 時,蛋白質(zhì)帶正電荷,應選用陽離子交換劑;當?shù)鞍踪|(zhì)等電點小于其所在緩沖液,蛋白質(zhì)帶負電荷,應選用陰離子交換劑。

強型離子交換劑適用的 pH 范圍很廣,所以常用它來制備去離子水和分離一些在pH 過高/過低的溶液中解離且較穩(wěn)定的物質(zhì)。弱型離子交換劑適用的 pH 范圍狹窄,在 pH 為中性的溶液中交換容量高,用它分離生命大分子物質(zhì)時,其活性不易喪失。

強酸性陽離子交換樹脂雖然可與很多陽離子交換,但對正電荷的膠體和高分子陽離子都不易吸附或吸附很少,所以一般用弱酸性樹脂分離堿性蛋白質(zhì)。強、弱型離子交換劑的交換容量與適用 pH 范圍的比較。

離子交換劑處于電中性時常帶有一定的反離子,使用時選擇何種離子交換劑,取決于交換劑對各種反離子的結(jié)合力。為了提高交換容量,一般應選擇結(jié)合力較小的反離子。據(jù)此,強酸型和強堿型離子交換劑應分別選擇 H 型和 OH 型;弱酸型和弱堿型交換劑應分別選擇 Na 型和 Cl 型。

交換劑的基質(zhì)是疏水性還是親水性,對被分離物質(zhì)有不同的作用性質(zhì),如吸附、分子篩、離子或非離子的作用力等。

常見問題

1、蛋白質(zhì)在低鹽濃度下可能發(fā)生沉淀,所以,在選擇鹽溶液之前,應先評估蛋白質(zhì)復合物在給定鹽溶液中的溶解性。

2、緩沖液的 pH 對于蛋白質(zhì)結(jié)合于 IEX 吸附劑的影響并呈一般性的趨勢,可以影響相互作用的強度。選擇緩沖液的 pH,應該確保蛋白質(zhì)和吸附劑在該環(huán)境下能夠穩(wěn)定(如避免使用pH過高/過低的溶液)。

3、可加少量還原劑或者去污劑防止蛋白聚集。

4、蛋白高鹽洗脫后盡快換至穩(wěn)定緩沖液中。

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